Restrikcijski enzimi su enzimi koji rezaju i jednu i dvolančanu DNA. Svaki restrikcijski enzim ima specifičnu nukleotidnu sekvencu, koja se zove restrikcijsko mjesto, koje prepoznaje i smanjuje. Restrikcijski enzimi koriste se za sekvenciranje DNA, mutacijsku analizu i kloniranje i amplifikaciju DNA. Znanstvenici koriste restrikcijske enzime za umetanje gena od interesa u ekspresijske vektore, molekule DNA koje se mogu odvajati od kromosomske DNA. Vektor koji sadrži genski interes može se zatim uvesti u bakterijski soj za ekspresiju i karakterizaciju proteina.
Video dana
Korak 1
Prepoznajte mjesta restrikcijske enzime na vašem vektoru tako da pogledate kartu ograničenja. Karta restrikcije će vam reći koji će enzimi smanjiti vaš vektor i gdje.
Korak 2
Odaberite restrikcijski enzim koji također ima mjesto na vašem genskom umetku, gledajući slijed umetka. Pobrinite se da je mjesto za ograničenje u položaju na vašem umetku izvan gene koji vas zanima, tako da ne izgubite dio gena.
Korak 3
Pobrinite se da nema duplikata mjesta restrikcije bilo gdje u vašem genskom umetku ili vektoru. To će uzrokovati više rezova u vašem DNK i dati vam pogrešne podatke.
Korak 4
Pokušajte odabrati restrikcijske enzime koji rezaju ljepljivim krajevima, a ne tupim krajevima. Ljepljive vrhove nastaju kada enzim smanjuje dvolančanu DNK na stupnjeviti način, ostavljajući jednolančani izron koji olakšava pričvršćivanje s umetkom koji je rezan na suprotan način. Blunt krajevi nastaju kada je dvolančana DNA izrezana na glatki način, a teže ih je pričvrstiti.
Izaberite drugi restrikcijski enzim za oba kraja umetka kako biste bili sigurni da je umetnut u vektor u pravilnoj orijentaciji i da se vektor ne prenese na sebe.Korak 6
Pokušajte odabrati dva restrikcijska enzima koji dobro funkcioniraju u istom puferskom sustavu i temperaturi. Ako to nije moguće, odvojeno izvodite svaku probavu.
Stvari koje trebate
Sekvenca genskog umetka
- Restrikcijska karta za vektor izbora
- Popis restrikcijskih enzima i njihova mjesta rezanja
- Savjeti
